В Закладки

Главная
Официальная
Новости
Курсовые работы
Дипломные проекты
Лекции и конспекты
Рефераты
Софт
Ссылки
Справочник Студента
Гостевая

Почта


Поиск по сайту:

          


















Дипломная работа по химии. Деградация фенантрена грибом белой гнили Plerotus ostreatus D1в условиях погруженного культивирования.

Дипломная работа по химии. Деградация фенантрена грибом белой гнили Plerotus ostreatus D1в условиях погруженного культивирования.

Министерство образования Российской Федерации

САРАТОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

ИМЕНИ Н.Г.ЧЕРНЫШЕВСКОГО

Кафедра органической и

биоорганической химии

Деградация фенантрена грибом белой гнили

Plerotus ostreatus D1в условиях погруженного культивирования.

ДИПЛОМНАЯ РАБОТА

студентки 5 курса химического факультета

Титовой Виктории Константиновны

Научные руководители

к.б.н с.н.с. ИБФРМ РАН Позднякова Н.Н.

д.б.н. профессор Турковская О.В.

Зав. кафедрой

профессор д.х.н. Кривенько А.П.

САРАТОВ 2003

СОДЕРЖАНИЕ

Перечень сокращений 4

ВВЕДЕНИЕ 5

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7

1.1 ПАУ как загрязнители окружающей среды 7

1.2 Грибы белой гнили: физиология и деструктивный потенциал 9

1.3 Деградация ПАУ грибами белой гнили 11

1.3.1 Педполагаемые пути метаболизма некоторых ПАУ грибами белой гнили 12

1.3.1.1 Метаболизм пирена 12

1.3.1.2 Метаболизм антрацена 13

1.3.1.2 Метаболизм флюорена 14

1.3.1.3 Метаболизм дибензотиофена 15

1.3.2 Деградация фенантрена грибами белой гнили 16

1.3.2.1 Деградация фенантрена Phanerochaete chrysosporium 17

1.3.2.2 Деградация фенантрена Phanerochaete laevis 22

1.3.2.3 Деградация фенантрена в твердофазной культуре 23

1.3.2.4 Деградация фенантрена Pleurotus ostreatus 24

1.4. Роль лакказ в деградации ароматических соединений 28

1.4.1 Роль лакказ в биодеградации лигнина 29

1.4.2 Участие лакказы в деградации ПАУ 30

1.4. Применение лакказы 32

2 ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 34

2.1 Изучение деградации фенантрена грибом Pleurotus ostreatus D1 в условиях погруженного культивирования 34

2.1.1 Деградация фенантрена при культивировании на минеральной среде 34

2.1.2 Деградация фенантрена при культивировании на богатой среде для базидиомицетов 39

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 45

3.1 Поддержание культуры гриба Pleurotus ostreatus D1 и получение инокулята 45

3.2 Твердофазное культивирование гриба 45

3.3 Погруженное культивирование гриба 46

3.4 Определение прироста мицелия 47

3.5 Методы экстракции 47

3.6 Хроматографические методы 47

3.6.1 Газовая хроматография 47

3.6.2 Тонкослойная хроматография 48

3.7 Спектральные методы 48

3.8 Определение активности лакказы 49

3.9 Реактивы и материалы 50

ВЫВОДЫ 51

ОСНОВНЫЕ ПРАВИЛА ТЕХНИКИ БЕЗОПАСНОСТИ И ОХРАНЫ ТРУДА 52

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 56

Перечень сокращений, условных обозначений, символов, единиц и терминов:

АБТС – 2,2-азино-ди-3-этилбензотиазолин-6-серная кислота

БСА – бычий сывороточный альбумин

ГБТ – 1-гидроксибензотриазол

ПААГ – полиакриламидный гель

ПАУ - полициклические ароматические углеводороды

ТСХ – тонкослойная хроматография

ЭДТА – этилендиаминтетрауксусная кислота

ЭПР – электронный парамагнитный резонанс

BRM – (basidiomyces rich medium) – богатая среда для базидиомицетов

HPLC - high pressure liquid chromatography - высокоэффективная жидкостная хроматография

Km – константа Михаэлиса-Ментен

SDS – sodium dodecyl sulfate (додецилсульфат натрия)

Vmax – максимальная скорость реакции

ВВЕДЕНИЕ.

Полициклические ароматические углеводороды (ПАУ) относятся к группе опасных веществ, загрязняющих окружающую среду. Многие из них оказывают токсическое действие на живые организмы, являясь мутагенными и концерогенными.

В окружающую среду ПАУ попадают в ходе естественных событий ( таких как лесной пожар), но в значительно большей степени в результате промышленных процессов/5/. ПАУ обнаружены в воздухе, почве, поверхностных и грунтовых водах, то есть в местах, где обитают живые организмы/14/.

Таким образом, очистка окружающей среды от ПАУ загрязнителей входит в сферу глобальной экологической проблемы, для решения которой необходимо искать наиболее эффективные способы.

В современных работах отечественных и зарубежных исследователей описывается способность некоторых микроорганизмов метаболизировать ПАУ до продуктов не токсичных для живых организмов, а также минерализовать их. Эти микроорганизмы (бактерии) способны использовать ПАУ как источник углерода. Однако не известны бактерии, способные эффективно разрушать ПАУ с четырьмя и более ароматическими кольцами/17/.

В последнее время в качестве деструкторов внимание исследователей привлекли грибы белой гнили. Эта группа базидиомицетов, наиболее активных деструкторов лигнина в природе, обладает способностью минерализовать углеводороды с четырьмя и более ароматическими кольцами. Это единственные эукариоты способные метаболизировать фенантрен, нафталин, антрацен, флюорантен, флюорен, пирен, бенз[а]пирен, бенз [а] антрацен, хризен, карбазол и многие другие. Они могут метаболизировать ПАУ в более высоких, чем бактерии концентрациях. Предполагают, что грибы белой гнили начинают атаку на полиароматический субстрат, а образующиеся при этом метаболиты являются субстратом для почвенных бактерий.

Изучение путей деградации ПАУ грибами белой гнили может создать фундаментальную основу для разработки технологии биоремидиации ПАУ-загрязненных почв и воды/69/.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1ПАУ как загрязнители окружающей среды.

Полициклические ароматические углеводороды (ПАУ) являются высокотоксичными органическими поллютантами, которые широко распространены в наземной и водной окружающей среде. Они представляют собой гомологи бензола, состоят из двух и более конденсированных ароматических колец и входят в состав каменноугольной смолы, креозота, грубых минеральных масел, нефти, а также образуются при неполном сжигании органического материала. Большинство ПАУ токсичны для человека и животных, многие из них, такие как бенз[a]пирен, являются мутагенными и канцерогенными /5/. С увеличением молекулярного веса этих соединений уменьшается растворимость в воде, что определяет потенциальную возможность накопления их в биологических мембранах и тканях. Они также связываются почвой и осадками и накапливаются в окружающей среде /14/.

Важным фактором процесса загрязнения ПАУ воды является способность жидких углеводородов (нефти) с большой скоростью растекаться по поверхности воды, образуя тонкую пленку большой площадью. Вследствие этого разливы нефти на воде считаются более опасными, чем на почве, где она до определенной степени удерживается частицами почвы. Известно, что литр нефти лишает кислорода 40 тысяч литров воды, тонна нефти загрязняет 12 кв. км. Водной поверхности. Содержание в воде нефтепродуктов выше 0,1 мг/л придает мясу рыб не устранимый ни при каких технологических обработках привкус и специфический запах нефти/69/.

Тяжелая фракция нефти часто оседает на дно водоемов, пагубно действует на икру, молодь, взрослую рыбу и их корм. Донные отложения, нефть и нефтепродукты, кроме того, являются источником вторичного загрязнения водоемов. Достаточно вылить в воду 1 литр нефти, чтобы погубить 100 млн. личинок рыб и других морских организмов, а в воды рек, озер и Мирового океана ежегодно по разным причинам и по заниженным оценкам поступает от 2 до 10 млн. тонн нефти. Космической съемкой зафиксировано, что уже почти 30% поверхности океана покрыто нефтяной пленкой, особенно загрязнены воды Средиземного моря, Атлантики и их берега. Попадание нефти в воду вредно и для здоровья человека, что связано с аккумулированием гидробионтами концерогенных многоядерных углеводородов и передачей их по пищевой цепи/5/.

ПАУ легко проникают в верхние слои почвы. Воздействие их на окружающую среду носит разноплановый характер. Часть углеводородов остается в почве за счет смачивания и адсорбции и затем поступает в корневую систему растений вместе с влагой и питательными элементами, необратимо угнетая развитие растений при концентрации свыше 2г на 1кг почвы (порог фитотоксичности). Разливы жидких углеводородов приводят к задержанию или полному выпадению фенофаз в развитии растений, вызывают морфологические изменения растений, задерживают на 20-30 дней начало вегетации.

В тундре при первом же попадании в почву нефти в колличестве 2-16 литров на 1 кв. км исчезает лишайниковая растительность. В лесах эта доза составляет 20-100 литров на 1 кв. км. (Некоторые виды растений выдерживают очень высокие концентрации ПАУ в почве, и их используют для рекультивации загрязненных территорий)/69/.

Часть углеводородов испаряется из почвы или разлагается в результате сложных биохимических реакций. Образованные пары и токсичные газы загрязняют атмосферу. Остальные углеводороды вымываются почвенными водами и поступают в реки и водоемы.

1.2 Грибы белой гнили: физиология и деструктивный потенциал.

Способность грибов разрушать лигниновый компонент древесины известна давно. Наиболее активными деструкторами лигнина в природе являются так называемые грибы белой гнили, которые образуют гетерогенную группу, состоящую большей частью из базидиомицетов, относящихся к семействам Agaricaceae, Corticaceae, Pleurotaceae, Strophariaceae и нескольких аскомицетов/15/. Так как в качестве лигнинолитиков изучены преимущественно базидиомицеты, то в узком смысле под грибами белой гнили обычно понимают лигнинолитические базидиомицеты. Наиболее подробно изучены Phanerochaete chrysosporium, Coriolus versicolor и Pleurotus ostreatus.

Хотя лигнин является потенциально богатым энергией материалом, он не может служить единственным источником углерода и энергии, его деградация возможна при наличии в среде ростового субстрата, такого как целлюлоза или глюкоза. Деградация лигнина является событием вторичного метаболизма и происходит когда в среде культивирования исчерпываются источники углерода, азота или серы /20,38,43/. Разложение лигнина - процесс окислительный, стимулирующее действие кислорода на биодеградацию лигнинового полимера характерно для всех грибов белой гнили /15/. Лигнинолитический процесс у этих грибов подвержен влиянию рН, максимум лигнинолитической активности приходится на рН 4,5 /15/.

Структура высокомолекулярной полимерной гидрофобной молекулы лигнина определяет свойства расщепляющей его ферментативной системы. Такая система должна быть внеклеточной негидролитической и неспецифической. Лигнинолитическая система грибов белой гнили является внеклеточной окислительной и неспецифической, и включает лигнин пероксидазу, Mn-пероксидазу и лакказу.

Грибы белой гнили известны также как активные деструкторы широкого ряда поллютантов, включая полихлорированные фенолы, нитро- и аминозамещенные фенолы, диоксины и ПАУ. Это единственные эукариоты способные разлагать полициклические ароматические углеводороды. Например, они могут метаболизировать фенантрен, нафталин, антрацен, флюорантен, флюорен, пирен, бенз [a]пирен, бенз[a]антрацен, хризен, карбазол и многие другие /14/. В отличие от бактерий, они могут метаболизировать ПАУ с 4 и более конденсированными кольцами. В настоящее время неизвестно ПАУ полностью устойчивых к деградации грибами белой гнили.

Эти грибы не используют ПАУ, также как и лигнин, в качестве единственного источника углерода и энергии, но способны кометаболизировать их. Полная минерализация ПАУ грибами белой гнили ограничена и составляет, по данным разных авторов, от 0,17% до 10%, большая часть этих веществ метаболизируется в гидрофильные гидроксилированные продукты, например дигидродиолы, хиноны и 2,2'-дифеновую кислоту - продукт расщепления ароматического кольца. Процесс деградации ПАУ, также как и процесс деградации лигнина является окислительным и протекает наиболее интенсивно при рН 4,0-5,0 /13,41/.

В отличие от деградации лигнина, деградация ПАУ грибами белой гнили в ряде случаев не зависит от концентрации азота. Например, Phanerochaete chrysosporium при культивировании на среде с высоким содержанием азота ( 2,4 мМ) метаболизировала 47,3% фенантрена за 18 суток, а в среде с низким содержанием азота (0,24 мМ) - 39,0% /20/.

Современные исследования деградации ПАУ грибами белой гнили направлены на детальное изучение метаболических путей и вовлеченных в них ферментных систем. Деградативную активность этих грибов в основном связывают с их внеклеточной лигнинолитической ферментной системой /50/.

1.3Деградация ПАУ грибами белой гнили.

Лигнинолитические грибы, которые вызывают белую гниль древесины — единственные эукариоты способные минерализовать ПАУ. Способность грибов белой гнили разлагать ПАУ связана,в основном, с лигнинолитической системой этих грибов.

Способность грибов белой гнили, особенно Phanerochaete chrisosporium , разлагать ПАУ— составные части креозота и каменноугольной смолы, широко используется. Первые исследования в этой области показали выделение меченного по углероду углекислого газа из меченного по углероду бенз[а]пирена жидкой культурой Phanerochaete chrisosporium. Исследования в жидкой культуре показали деградацию широкого спектра ПАУ, включая фенантрен, флюорен, бензофлюорен, антрацен, пирен, флюорантен/8/.

1.3.1Предполагаемые пути метаболизма некоторых ПАУ грибами белой гнили.

1.3.1.1.Метаболизм пирена.

Пирен [14 С] метаболизировался культурой Pleurotus ostreatus, выращенной на богатой среде для базидиомицетов. Ерез 21 день инкубации 91% пирена метаболизировался до пирентранс - 4,5- дигидродиола, а 0,4% минерализовались до СО2 и воды. Метаболиты были разделены с помощью HPLC и идентифицированы с использованием УФ-спектрометрии и масс-спектрометрии/6/.

Рис.1Предполагаемый путь метаболизма пирена в культуреPleurotus ostreatus, выращенной на BRM.

1.3.1.2Метаболизм антрацена.

Культура Pleurotus ostreatus, выращенная на BRM 74% добавленного антрацена [14С] метаболизировала до 9,10 -антрахинона и антрацен транс-1,2-дигидродиола, а 0,62% минерализовала до СО2 и Н2О за 21 сутки культивирования. Метаболиты были разделены с использованием HPLC и идентифицированы по спектрам кругового дихроизма/6/.

Рис.2 Предполагаемый путь метаболизма антрацена в культуре Pleurotus ostreatus, выращенной на BRM.

1.3.1.3Метаболизм флюорена.

Pleurotus ostreatus, выращенной на BRM, за 21 сутки инкубации метаболизировал 96% флюорена и минерализовал 0,19% до СО2 и H2O. Метаболиты были разделены с помощью HPLC и идентифицированы с помощью УФ спектрофотометрии. Определили два основных метаболита 9-флюоренол и 9-флюофенон/10,11/

Рис.3 Предполагаемый путь метаболизма флюорена в культуре Pleurotus ostreatus, выращенной на BRM.

1.3.1.4Метаболизм дибензотиофена.

Приблизительно 84% дибензотиофена, добавленного в культуру Pleurotus ostreatus, выращенной на BRM, метаболизировалось за 21 сутки. Метаболиты были разделены с помощью HPLC и идентифицированы с использованиум УФ спектрофотометрии. Конечный продукт был определен как дибензотиофенсульфон/10,12/.

Рис.4 Предполагаемый путь метаболизма дибензотиофена в культуре Pleurotus ostreatus, выращенной на BRM.

1.3.2 Деградация фенантрена грибами белой гнили.

Фенантрен продуцируется при сгорании каменноугольного топлива и в других промышленных процессах, в природе - при горении леса. Он не является мутагенным и канцерогенным для человека, но токсичен для водных организмов. Фенантрен часто используют как модельное соединение для изучения биодеградации ПАУ, так как он обнаруживается в высоких концентрациях в ПАУ-содержащих образцах, вместе с тем многие ПАУ, содержащие производные фенантрена, являются канцерогенными.

Бактерии используют фенантрен как единственный источник углерода и энергии. Бактериальные диоксигеназы его окисляют преимущественно в положениях С3-С4 и С5-С6 с образованием фенантрен-цис-дигидродиолов. Далее образуется 1-гидрокси-2-нафтоевая кислота и протокатеховая кислота или катехол, которые в конечном итоге могут быть минерализованы /17/. Streptomyces flavovirens и морские цианобактерии Agmenellum quadruplicatum метаболизируют фенантрен в фенантрен-транс-9,10-дигидродиол /5/.

Грибы не используют фенантрен как единственный источник углерода и энергии, но способны кометаболизировать его.

У нелигнинолитических грибов в метаболизме фенантрена участвуют цитохром P-450 монооксигеназа и эпоксид гидролаза. Процесс происходит с образованием фенантрен-транс-1,2-, фенантрен-транс-3,4- и фенантрен-транс-9,10-дигидродиолов, 1-, 2-, 3-, 4- и 9-фенантролов и сульфатных, глюкозидных и глюкуроновых коньюгатов первичных метаболитов. Однако, полной минерализации фенантрена до СО2 и Н2О не происходит.

Деградация фенантрена грибами белой гнили приводит к расщеплению ароматического кольца с последующей минерализацией образующихся продуктов /6/. Способность раскрывать и минерализовать ароматическое кольцо характерна для лигнинолитических грибов, но отсутствует у нелигнинолитических.

Как известно, лигнин пероксидазы, Мп-пероксидазы и лакказы продуцируются всеми грибами белой гнили и все они, как предполагают, вовлечены в деградацию поллютантов этими грибами.

1.3.2.1 Деградация фенантрена Phanerochaete chrysosporium.

До недавнего времени большинство исследований деградации ПАУ проводили с единственным видом - Phanerochaete chrysosporium, который, как известно, метаболизирует и минерализует широкий ряд ксенобиотиков. В состав его внеклеточного ферментного комплекса входят лигнин пероксидаза и Mn-пероксидаза, лакказа у большинства штаммов этого гриба не обнаружена или ее активность незначительна.

В ранних работах многих авторов деградация фенантрена связывается с переходом грибной культуры к вторичному метаболизму и продукцией внеклеточных пероксидаз. Так например, Bumpus et al. показали, что при культивировании на минеральной среде Кирка в условиях лимита по азоту Phanerochaete chrysosporium превращает 7,7% фенантрена в СО2 за 27 дней при 390С. Минерализация 14С-фенантрена была наибольшей между 3 и 21 сутками и зависела от наличия в среде культивирования ростового субстрата. Внесение глюкозы через 30 дней увеличивало скорость минерализации 14С-фенантрена/14/. Morgan et al. показали, что в этих же условиях Phanerochaete chrysosporium метаболизирует 28% фенантрена в водорастворимые продукты и 1,3% в СО2 за 70 суток при 300С /52/.

Однако позже было обнаружено, что Phanerochaete chrysosporium разлагает фенантрен не только в условиях лимита по азоту, но и на среде Кирка, содержащей избыток азота. Штаммы ВКМ F-1767 и МЕ 446 не продуцирующие лигнин пероксидазу и Mn-пероксидазу при росте на среде с богатым азотом, метаболизировали 68% фенантрена за 5 дней. Мутант штамма МЕ 446, который не продуцирует лигнин пероксидазу и Mn-пероксидазу, разлагал фенантрен как на среде с лимитом по азоту, так и на среде с богатым азотом. Авторы предположили, что лигнин пероксидаза и Mn-пероксидаза не являются необходимыми для деградации фенантрена /20/.

Минерализации фенантрена этим грибом не было обнаружено и на богатой среде (мальт-экстракт - глюкоза). Были идентифицированы продукты его деградации: фенантрен-транс3,4-дигидродиол, фенантрен-транс9,10-дигидродиол, 3-фенантрол, 4-фенантрол, 9-фенантрол, 9-фенантрил-?-D-глюкопиранозид (рис.1).

Рисунок 1: Предполагаемый путь метаболизма фенантрена Phanerochaete chrysosporium.

Фенантрен-транс9,10- и фенантрен-транс3,4-дигидродиолы образуются соответствующими ферментами монооксигеназой и эпоксид гидролазой. Однако, фенантрен-9,10- и фенантрен-3,4-оксиды, которые также являются вероятными интермедиатами этого процесса, не были обнаружены. ПАУ ароматические оксиды нестабильны в водных растворах и/или изомеризуются в фенолы, или гидратируются эпоксид гидролазой в соответствующобеспечивающих продукцию внеклеточных пероксидаз этим грибом. При культивировании на богатых средах, когда синтеза пероксидаз не происходило, деградация фенантрена останавливалась на стадии образования дигидродиолов.

Окисление фенантрена до продуктов расщепления ароматического кольца изучали во внеклеточной системе Phanerochaete chrysosporium, содержащей концентрат лимитированной по азоту культуральной жидкости гриба, Mn2+ и tween-80. Такая внеклеточная система окисляла 12%-16% фенантрена c образованием продукта расщепления ароматического кольца - 2,2’-дифеновой кислоты за 6-8 дней и также продуцировала другие неидентифицированные продукты, которые составляли 40%-50% от исходного материала /50/.

Чистая Mn-пероксидаза, выделенная из погруженной культуры этого гриба была также эффективна как и грубый ферментный препарат только в присутствие tween-80. Ясно, что окисление фенантрена не является результатом прямого катализа Mn-пероксидазой, так как реакция требует ненасыщенных липидов. Система не окисляла фенантрен, когда tween-80 был заменен другими сурфактантами, такими как tween-20, n-додецил-?-d-мальтозид или 3-[(3-хлорамидопропил)-диметил-аммоний]-1-пропансульфонат. Tween-80 содержит эфиры ненасыщенных жирных кислот, тогда как другие изученные сурфактанты - нет. Дальнейшие исследования показали, что tween-80 в бесклеточной системе может быть заменен эфирами ненасыщенных жирных кислот, например эфирами моноолеиновой (18:1) или монолиноленовой (18:2) кислот /50/.

Обнаружено, что экстрагируемые липиды из мицелия Phanerochaete chrysosporium содержат ненасыщенные жирные кислоты, таким образом есть грибы белой гнили продуцируют внеклеточные липиды доступные для Mn-пероксидазы. Грибные пероксидазы связаны с плазматической мембраной, где они могут катализировать перокисление мембранных липидов /50/.

Перокисление липидов часто инициируется ионами переходных металлов, которые реагируют с экзогенными липид пероксидазами. В случае бесклеточной системы Phanerochaete chrysosporium возможными инициаторами являются Mn2+, Mn3+ и пероксидазный гем. Для окисления фенантрена требуются и Mn-пероксидаза, и Mn2+. Реакции не происходило, если Mn-пероксидаза была заменена на хелаты Mn3+-?-гидроксикислот, которые являются продуктами Mn-пероксидазы. По-видимому, гем Mn-пероксидазы играет некоторую значительную роль кроме генерирования Mn3+ в бесклеточных системах /50/.

Кислородные радикалы, продуцируемые при перокислении липидов, известны как триггеры соокисления ксенобиотиков. Ароматические соединения, которые содержат олефиновую двойную связь: бенз[a]пирен-7,8-дигидродиол, циклопентено[c,d]пирен и стирен пероксирадикалы превращают в эпоксиды. Фенантрен, вероятно, окисляется с образованием фенантрен-9,10-хинона, который впоследствие подвергается свободному расщеплению по site 9-10 с образованием дифеновой кислоты /50/.

Таким образом, Mn-пероксидаза катализирует Mn-зависимое перокисление ненасыщенных жирных кислот. Она также окисляет фенантрен до дифеновой кислоты в реакции, которая требует ненасыщенных липидов, О2 и Mn2+ и которая ингибируется веществом, связывающим свободные радикалы - бутилированным гидрокситолуолом. Интактная Phanerochaete chrysosporium окисляет фенантрен до дифеновой кислоты подобным образом, что и Mn-пероксидаза-липидная система, используя пути, которые стимулируются Mn2+. Эти результаты позволяют предположить вовлечение внеклеточного перокисления липидов, катализируемого Mn-пероксидазой, в окисление фенантрена Phanerochaete chrysosporium /50/.

Таким образом, Phanerochaete chrysosporium может минерализовать фенантрен, окисляя его вначале в фенантрен-9.10-дигидродиол, затем в продукт расщепления кольца 2.2’-дифеновую кислоту. Такая минерализация возможна, с одной стороны, в лигнинолитических условиях, когда начальную атаку на субстрат осуществляют цитохром Р-450 монооксигеназа и эпоксид гидролаза, а расщепление ароматического кольца осуществляют лигнинолитические пероксидазы. С другой стороны - при сопряжении окисления фенантрена и перокисления липидов, катализируемого Mn-пероксидазой этого гриба. В нелигнинолитических условиях Phanerochaete chrysosporium метаболизирует фенантрен в фенантрен-транс-3,4- и фенантрен-транс-9,10-дигидродиолы; 3-, 4- и 9-фенантролы, и глюкозидные коньюгаты 9-фенантрола, разрыва ароматического кольца и минерализации субстрата при этом не происходит. По-видимому, Phanerochaete chrysosporium имеет множественные ферментные пути метаболизма фенантрена. /5/

1.3.2.2 Деградация фенантрена Phanerochaete laevis.

Недавно способность деградировать поллютанты начали изучать и у других видов Phanerochaete, например Phanerochaete laevis.

Phanerochaete laevis относится к группе грибов белой гнили, продуцирующих Mn-пероксидазу и лакказу, в отсутствие лигнин пероксидазы. Мп-пероксидаза была доминирующим ферментом в погруженной культуре Phanerochaete laevis. Ее активность появлялась на 3 сутки, быстро увеличивалась до 5 и оставалась постоянной, с некоторыми отклонениями, в течении 5 недель продолжительности эксперимента. Активность лакказы последовательно определялась в культуральной жидкости на низком уровне (< 5 ед/мл).

Обнаружено, что в условиях погруженного культивирования на минеральной среде, содержащей tween-20, Phanerochaete laevis 48,6% фенантрена метаболизировал до продуктов, растворимых в органических растворителях, 6,1% - до водорастворимых продуктов и только 0,2% было минерализовано. Вместе с тем, инкубация фенантрена с чистой Mn-пероксидазой этого гриба не приводила к заметной трансформации субстрата/7/. Авторы предполагают, что способность Phanerochaete laevis, в чьей лигнинолитической системе доминирует Mn-пероксидаза, вызывать трансформацию фенантрена in vivo может быть сопряжена с перокислением липидов. В этом случае действия внеклеточных ферментов Phanerochaete laevis не только достаточно для начального окисления фенантрена, но и расщепления ароматического кольца образующихся метаболитов /7/.

Интересно, что продукты деградации фенантрена in vivo Phanerochaete laevis отличаются от продуктов показанных для Phanerochaete chrysosporium. В последнем случае, трансформация ПАУ часто характеризуется накоплением хиноновых интермедиатов, которые могут быть конечными продуктами деградации. Phanerochaete laevis, напротив, вызывает более полную деградацию фенантрена за 4 недели, с незначительным накоплением хиноновых интермедиатов /7/.

1.3.2.3 Деградация фенантрена в твердофазной культуре грибов белой гнили.

В последние годы изучение деградации ПАУ проводят в условиях максимально приближенных к природным. Полиароматический субстрат адсорбировали на пшеничной соломе, которую затем засевали грибной культурой. Адсорбция ПАУ на соломе делает ПАУ более удобными и доступными для минерализации. Рост на соломе значительно стимулирует продукцию соответствующих ферментов /59/.

Так например, Trametes versicolor и Kuehneromyces mutabilis минерализовали 15,5% и 5% фенантрена, соответственно, при культивировании на соломе за 63 дня, в отличие от погруженной культуры, где минерализация достигала 13,8% для Trametes versicolor и 4,3% для Kuehneromyces mutabilis. Оба эти гриба продуцируют лигнин пероксидазу, Mn-пероксидазу и лакказу. Активности всех внеклеточных ферментов были выше в твердофазной “соломенной” культуре.

Доминирующим метаболитом, определенным при деградации фенантрена у Trametes versicolor, Kuehneromyces mutabilis, был фенантрен 9,10-дигидродиол.

1.3.2.4 Деградация фенантрена Pleurotus ostreatus.

Trametes versicolor, Bjerkandera sp., Pleurotus ostreatus более перспективны, чем Phanerochaete chrysosporium из-за их способности минерализовать большинство ПАУ до СО2 и Н2О.

Pleurotus ostreatus кроме фенантрена метаболизирует флюорен, антрацен, флюорантен, пирен, бенз[a]пирен и некоторые другие ПАУ. Он отличается от Phanerochaete chrysosporium тем, что не проявляет лигнин пероксидазной активности, его лигнин-деградирующая активность коррелирует с продукцией лакказы. Было высказано предположение, что лакказа может быть вовлечена в окисление ПАУ этим грибом /5/.

Pleurotus ostreatus минерализовал ПАУ быстрее, чем другие грибы белой гнили. Минерализация фенантрена на богатой среде для базидиомицетов (BRM) начиналась на 3 день, достигала плато на 8 или 11 день и составляла 1,8%.

При этом внеклеточная ферментативная активность достигала максимума одновременно с максимумом минерализации. Лакказная активность на богатой среде для базидиомицетов в присутствие фенантрена составляла 57 ед./мл /5/.

Однако, когда ции были идентифицированы HPLC как фенантрен-транс-9,10-дигидродиол и 2,2’-дифеновая кислота. Другие метаболиты образуются в количествах недостаточных для их определения и идентификации.

Образование фенантрена-транс-9,10-дигидродиола предполагает начальное гидроксилирование субстрата цитохром P-450 монооксигеназой.

Далее происходит расщепление ароматического кольца с образованием 2,2’-дифеновой кислоты и, в конечном итоге, СО2 (рис.2). 2,2’-дифеновая кислота может быть продуктом реакции, катализируемой лакказой /5/.

Рисунок 2: Предполагаемый путь метаболизма фенантрена Pleurotus ostreatus.

Активности лакказы и Mn-пероксидазы были определены в культуральной жидкости Pleurotus ostreatus. Для определения продуктов начального окисления или расщепления ароматического кольца культуральную жидкость инкубировали с фенантреном или фенантрен-транс-9,10-дигидродиолом. В этих экспериментах метаболиты обнаружены не были /4/.

Вместе с тем в экспериментах с целым мицелием была показана продукция фенантрен-транс-9,10-дигидродиола и 2,2’-дифеновой кислоты из фенантрена, 2,2’-дифеновой кислоты из фенантрен-транс-9,10-дигидродиола или фенантрен-9,10-хинона и исчезновение 2,2’-дифеновой кислоты, когда она была добавлена одна.

На основании структуры образованных метаболитов авторы предполагают, что первый этап трансформации этого ПАУ катализируют цитохром Р-450 монооксигеназа и эпоксид гидролаза. Цитохром Р-450 монооксигеназа, по-видимому, начальный окислительный фермент, атакующий ароматическое кольцо. Она включает атом кислорода в ксенобиотик, образуя фенантрен-9,10-оксид, а другой атом кислорода - в воду. Образовавшийся эпоксид нестабилен и подвергается дальнейшим реакциям, перестраиваясь или гидратируясь эпоксид гидролазой в фенантрен-9,10-транс-дигидродиол /4/.

Продукт расщепления ароматического кольца 2,2’-дифеновая кислота образуется из фенантрена через фенантрен-транс-9,10-дигидродиол или фенантрен-9,10-хинон. Роль лигнинолитической системы в механизме расщепления ароматического кольца Pleurotus ostreatus не ясна. 2,2’-дифеновая кислота может продуцироваться и Mn-пероксидазой, и лакказой этого гриба. Чистая лакказа не окисляет фенантрен в различных экспериментальных условиях. Однако показано, что выделение СО2 при деградации фенантрена Pleurotus ostreatus 188, который является слабым продуцентом лакказы, ниже, чем высоко-лакказным штаммом Pleurotus ostreatus /4/.

В настоящее время вопрос о роли лигнинолитических ферментов в деградации ПАУ грибами белой гнили все еще остается открытым. Ряд авторов считают, что ключевую роль в этом процессе может играть лакказа.

Так как деградация ПАУ происходит на богатой питательной среде, когда не происходит продукции лигнин пероксидазы и Мп-пероксидазы, то по-видимому, в этих условиях расщепление ароматического кольца могут катализировать ферменты оксидазной природы, например, лакказа. Другим подтверждением важной роли лакказы в деградации ПАУ является тот факт, что лигнинолитические пероксидазы могут окислять ПАУ с потенциалом ионизации не более 7,55 eV, тогда как лакказа – с потенциалом ионизации до 8,0 eV /18/.

Следует отметить, что, как правило, грибы - наиболее активные деструкторы ПАУ одновременно являются мощными продуцентами лакказы. Хотя не было обнаружено четкой корреляции между продукцией лакказы и деградацией ПАУ, каталитические свойства этого фермента позволяют предположить, что лакказа может играть одну из ключевых ролей в процессе деградации ксенобиотиков ароматической природы грибами белой гнили.

1.4 Роль лакказы в деградации ароматических соединений.

Лакказа - один из ферментов, которые стали объектом исследования с конца 19 века. Впервые лакказа была обнаружена в соке японского лакового дерева Rhus vernicifera в 1883 году, а в последствии у некоторых грибов: Coriolus versicolor /25/, Trametes spp. /6/, Phlebia radiata /2/, Pycnoporus сinnabarinus /32/, Aspergillus nigulans /48/, Neurospora сrassa /29/, Podospora anserina /23/, Botrytis cinerea /27/, Fomes annosus /27/, Lentinus edodes /47/, Pholiota mutabilis /48/, Pleurotus ostreatus /46/, Rhizoctonia praticola /9/. В настоящее время известен только один вид бактерий - Azospirillum lipoferum, синтезирующий лакказу /21/, поэтому в литературе лакказы описываются как грибные ферменты.

Лакказа (п-дифенол: кислород оксидоредуктаза, КФ:1.10.3.2) принадлежит к мультиядерным медьсодержащим оксидазам. Этот фермент катализирует окисление различных органических соединений, восстанавливая при этом молекулярный кислород воздуха до воды /56/.

1.4.1 Роль лакказы в биодеградации лигнина.

Определение роли лакказы в биодеградации лигнина следует из серии исследований, показывающих, что она может участвовать в реакциях окисления фенолов, требующихся для лигнинолизиса. Например, лакказа катализирует расщепление С?-С? связи в фенольных димерных модельных соединениях лигнина ?-1 и ?-о-4 типов, окисление по С? и отщепление алифатической цепи от ароматического кольца в модельных соединениях ?-1 типа, расщепление ароматического кольца 4,6-ди(трет-бутил)гваякола /27,32,36,39/.

Однако, фенольные структуры сравнительно редки в лигнине, если ферментативное окисление ограничено только фенольными структурами, то маловероятно, что происходит разрушение большинства связей в лигнине.

Тот факт, что в присутствии определенных медиаторов лакказа способна окислять и нефенольные субстраты: модельные соединения лигнина ?-1 типа и вератриловый спирт /12/ показывает, что лакказа в деполимеризации лигнина может окислять и нефенольные структуры /67/.

Кроме того, обнаружено, что в системе in vitro лакказа и Mn-зависимая пероксидаза, действуя синергически, разлагают лигнин. Авторы показали, что лакказа из Coriolus versicolor может продуцировать Mn3+ из Mn2+ в присутствии дополнительного фенольного субстрата, а Mn3+ может выступать в роли окислителя /2/.

Итак, лакказа может прямо или опосредованно окислять значительную часть структурных связей в лигнине.

Было показано, что лакказа может также выполнять вспомогательные функции в биодеградации лигнина /6/. Все ферменты, вовлеченные в разложение лигнина, продуцируют реакционно способные и, следовательно, токсичные соединения. Возможно, одна из функций лакказ - убирать эти соединения с помощью полимеризации, чтобы они не могли проникнуть в гифы гриба /66/.

Таким образом, лакказа является важным компонентом лигнинолитического ферментного комплекса у грибов белой гнили /67/.

1.4.2 Участие лакказы в деградации полициклических

ароматических углеводородов.

Так как лакказе отводится одна из основных ролей в процессе биодеградации лигнина, предположили, что и в биотрансформации ПАУ этот фермент играет важную роль.

Эксперименты последних лет показали, что очищенные лакказы из различных грибов белой гнили способны окислять широкий спектр ПАУ/12/. Так лакказа из Trametes versicolor способна окислять более 14 различных ПАУ /47/. Скорость прямого окисления ПАУ чистым ферментом не высока. Однако, в присутствии медиатора, который действует как переносчик электронов и активатор фермента скорость биотрансформации ПАУ значительно возрастает, а в тех случаях, когда лакказа непосредственно не окисляет ПАУ, медитор может "спровоцировать" реакцию. Наиболее распространенные медиаторы - 1-гидроксибензотриазол (ГБТ) и АБТС. Так, при окислении пирена и без[a]антрацена лакказой T.versicolor скорость деградации увеличивалась с 8 и 6% до 48 и 53% в присутствии ГБТ, соответственно (за 24 часа инкубации) /47/. Лакказа Piсnoporus cinnabarinus окисляет 95% бенз[a]пирена за 24 часа инкубации только в присутствии АБТС /55/.

Продуктами окисления ПАУ лакказой являются, как правило, соответствующие хиноны, менее токсичные и более гидрофильные /13,38,40/ они в свою очередь также могут быть субстратами для лакказы. Некоторые ПАУ под воздействием лакказы и в присутствии медиатора полимеризуются /47/. Jonas c cоавторами показали, что 2-гидроксидибензофуран под действием лакказы из T.versicolor и P. cinnabarinus олигомеризуется, выпадая в осадок. Олигомеризованные (ди- и тримеры) продукты менее токсичны и более гидрофобны, что позволяет легко их отделить .

Способность лакказы окислять ПАУ зависит от величин потенциалов ионизации этих субстратов. Антрацен и бенз[a]пирен, потенциалы ионизации которых ниже 7,45 могут быть окислены лакказой, тогда как флюорантен и фенантрен с потенциалами ионизации больше 8,00 остаются неокисленными. Величины потенциалов ионизации для катализируемоего лакказой окисления ПАУ находятся в пределах 7,45-8,00 эВ /18/.

Также как и лигнинолитические пероксидазы, лакказа может катализировать окисление субстратов в растворах органических растворителей. Катализируемое лакказой окисление ПАУ при концентрации растворителя 0,8% позволяет предположить, что уровень растворимости требуемый для окисления ПАУ лакказой ниже, чем требуемый для лигнин пероксидазы и Mn-пероксидазы /18/. По-видимому, активный центр лакказ более доступен для гидрофобных субстратов, чем активные центры лигнин пероксидазы и Mn-пероксидазы. Способность лакказ катализировать трансформацию субстратов в органических растворителях может способствовать объяснению механизма окисления лакказой гидрофобных субстратов, таких как лигнин, лигниноподобные соединения и ПАУ /45/.

Желтая лакказа продуцируемая при культивировании на природном субстрате грибами белой гнили, также как и пара синяя лакказа-переносчик электронов, приобретает способность окислять широкий спектр соединений нефенольной природы. Так как активный центр этого фермента предположительно модифицирован продуктами деградации лигнина, то, по-видимому, этот “модификатор, может выполнять роль переносчика электронов, аналогичного АБТС в паре АБТС-синяя лакказа /66/. Предполагается, что в этот спектр войдет и группа полиароматических углеводородов. В настоящее время в доступной нам литературе не обнаружено сведений о способности желтой лакказы окислять полициклические ароматические углеводороды.

1.4.3 Применение лакказы.

В настоящее время лакказы применяются в различных сферах биотехнологии. На основе лакказы разработан высокочувствительный метод ферментативного иммуноанализа, позволяющий определять концентрацию иммуноглобулина G человека и мыши до 2,5*10-12. Разработаны биосенсорные системы на основе лакказы. Этот фермент применяется в органическом синтезе (например, винбластина, используемого в терапии лейкемии) /71/.

Однако, основной сферой применения лакказы остается биодеградация лигнина и лигниноподобных соединений, а также веществ имеющих структуру сходную со структурой мономеров лигнина, таких как ПАУ. В настоящее время нет сведений об использовани лакказы для биологической очистки ПАУ-загрязненных почв и воды, но свойства этого фермента делают его перспективным для создания биопрепаратов и разработки технологий биоочистки.

2 ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

2.1 Изучение деградации фенантрена грибом Pleurotus ostreatus D1 в условиях погруженного культивирования.

Объектом нашего исследования был выбран гриб белой гнили Pleurotus ostreatus, который не только способен минерализовать широкий спектр ПАУ, но и является одним из наиболее мощных продуцентов лакказы.

Целью настоящей работы явилось изучение деградации типичного представителя ПАУ- фенантрена грибом белой гнили Pleurotus ostreatus D1 в условиях погруженного культивирования.

2.1.1 Деградация фенантрена при культивировании на минеральной среде.

Изучение деградации фенантрена штаммом гриба Pleurotus ostreatus D1 проводили в условиях погруженного культивирования на минеральной среде Кирка, которую часто используют для изучение деструктивной активности грибов белой гнили. Фенантрен вносили через 3 суток культивирования до конечной концентрации 50 мг/л. Культивирование проводили при 290С, при постоянной аэрации, в течение 14 суток.

На первом этапе исследований необходимо было подобрать условия экстракции фенантрена из среды культивирования и методику его обнаружения. Через 14 суток культивирования грибной мицелий удаляли фильтрованием через бумажный фильтр, экстракцию фенантрена проводили отдельно из мицелия и культуральной жидкости. Из культуральной жидкости фенантрен экстрагировали дважды 3 мл хлороформа в течение 10 мин. на качалке, экстракты объединяли, сушили безводным Na2SO4 и переносили в мерные пробирки. Осадок Na2SO4 дважды промывали 1 мл хлороформа, экстракты и промывку объединяли и снова сушили безводным Na2SO4.

Бумажные фильтры с мицелием сушили до постоянного веса, мицелий шпателем переносили в пробирку и экстрагировали 3 мл хлороформа в течение 5 мин. при постоянном перемешивании. Экстракты сушили безводным Na2SO4, фильтровали через бумажные фильтры от остатков мицелия и переносили в мерные пробирки. Осадок Na2SO4 и фильтры дважды промывали 1 мл хлороформа, экстракты и промывку объединяли и снова сушили безводным Na2SO4. Определение фенантрена в экстрактах проводили методом газовой хроматографии.

Анализ экстрактов мицелия не показал наличия фенантрена, адсорбированного на мицелии. По данным разных авторов количество фенантрена, адсорбированного на мицелии не превышает 3-5% . Однако, большинств зарубежных исследований проводится с использованием радиоактивной метки, которая позволяет получить более достоверные количественные результаты. По-видимому, газовая хроматография не позволяет достоверно определить минимальные количества фенантрена.

Анализ экстрактов культуральной жидкости показал, что на минеральной среде гриб Pleurotus ostreatus D1 метаболизирует около 38,4%+2,0% фенантрена за две недели.

Далее нами было исследовано влияние различных источников углерода на деградацию фенантрена этим грибом. В качестве источников углерода использовали глюкозу, мальтозу и целлюлозу. Из результатов, представленных в таблице 5 видно, что наиболее активно деградация фенантрена происходит при использовании мальтозы в качестве ростового субстрата.

таблица 2: Влияние на деградацию фенантрена Pleurotus ostreatus D1 различных источников углерода.

деструкция, % источники углерода

мальтоза глюкоза целлюлоза

79,3+6,5 38,4+2,0 0

Прирост мицелия гриба оценивали визуально. Обнаружено, что при культивировании с глюкозой или мальтозой в качестве ростового субстрата и фенантреном образуется примерно одинаковое количество мицелия. В варианте с целлюлозой и фенантреном прироста мицелия практически не происходило, в то же время в контрольном варианте (без фенантрена) целлюлоза служила хорошим источником углерода для этого гриба. По-видимому, фенантрен ингибирует рост гриба в присутствии целлюлозы.

В течение всего времени эксперимента контролировали продукцию лакказы грибом. В этих условиях нами были обнаружены только следовые количества фермента не превышающие 5-7 мкмоль/мин/мл. Литературных данных о продукции лакказы в ходе деградации фенантрена на минеральной среде Кирка нами не обнаружено.

Через 14 суток культивирования гриба остаточный фенантрен и продукты его деградации экстрагировали хлороформом. Экстракты анализировали методом газовой хроматографии и спектрофотометрически.

Одним из признаков образования окисленных метаболитов в ходе деградации ароматических веществ является изменение цвета среды культивирования. Обнаружено, что через 14 суток культивирования Pleurotus ostreatus D1 в присутствии мальтозы культуральная жидкость приобретала коричневый цвет, тогда как при культивировании в присутствии глюкозы - оставалась прозрачной. Спектрофотометрический анализ хлороформенных экстрактов культуральной жидкости представлен на рисунке 7. Во всех вариантах обнаружено снижение максимума поглощения при 255 и 295 нм, а также снижение минорного пика поглощения при 275 нм. В варианте с глюкозой пик при 275 нм становится более четко выраженным, а также образуется дополнительный минорный пик при 310 нм. В варианте с мальтозой практически не обнаруживается максимум при 255 нм, доминирующим становится пик при 275 нм, а вместо характерного максимума фенантрена образуется плато от 290 до 310 нм. Изменение спектров поглощения хлороформенных экстрактов культуральной жидкости после культивирования гриба также свидетельствует об образовании интермедиатов деградации фенантрена.

Рисунок 7: Спектры поглощения экстрактов культуральной жидкости после культивирования Pleurotus ostreatus D1 на средах с фенантреном

Из данных литературы известно, что на процесс деградации гидрофобных субстратов грибами белой гнили влияют поверхностно-активные вещества. Наиболее часто в этом качестве используются tween"ы, которые, как предполагают, являются нетоксичными для этих организмов и увеличивают доступность гидрофобных субстратов для грибов. Нами было изучено влияние tween-20, -40, -80 на деградацию фенантрена грибом Pleurotus ostreatus D1. Обнаружено, что в контрольном варианте, не содержащем твина, деструкция составляла около 36% за 7 суток (таблица 3). Внесение tween-40 практически не влияло на деградацию фенантрена, а tween-20 – увеличивал только на 22%. Наиболее активно деградация фенантрена происходила при внесении tween-80, она увеличивалась на 54% по сравнению с контролем.

Таблица 3: Влияние на деградацию фенантрена Pleurotus ostreatus D1 поверхностно-активных веществ.

деструкция, % контроль tween-20 tween-40 tween-80

35,95+2,1 46,27+3,8 34,21+3,3 78,25+5,7

Полученные результаты хорошо согласуются с данными Moen & Hammel, которые показали увеличение деградации фенантрена в бесклеточной системе Phanerochaete chrysosporium, содержащей tween-80. Авторы объясняют это сопряжением окисления фенантрена и перокисления липидов, катализируемым Mn-пероксидазой /50/.

Таким образом, нами была разработана методика экстракции фенантрена из погруженной культуры гриба Pleurotus ostreatus D1, которая позволяет полностью извлечь это вещество и дает достоверные результаты. Нами было обнаружено, что Pleurotus ostreatus D1 метаболизирует фенантрен в условиях погруженного культивирования, наиболее активно этот процесс происходит при использовании мальтозы в качестве источника углерода, деструкция составляет 79% за 14 суток культивирования. Показано, что процесс деградации фенантрена подвержен влиянию tween'ов. Внесение tween-80 в среду культивирования увеличивало деградацию фенантрена в 2 раза.

2.1.2 Деградация фенантрена при культивировании на богатой среде для базидиомицетов.

Деградацию фенантрена изучали на богатой среде для базидиомицетов. Анализ пророста мицелия в ходе эксперимента показал, что в контрольных вариантах на 3 и 10 сутки культивирования продуцировалось в 1,2-1,3 раза больше мицелия, чем в вариантах с фенантреном (табл.4). Однако на 7 сутки отмечено резкое снижение количества мицелия - в 2,2 раза. По-видимому, фенантрен практически не токсичен для гриба, однако, в процессе его деградации образуются метаболиты, ингибирующие рост мицелия.

Таблица 3: Прирост мицелия при культивировании Pleurotus ostreatus D1 на богатой среде для базидиомицетов.

Время культивирования, сутки

Варианты 0 3 7 10

Контроль, мг 0 387,3?9,4 718,7?35,2 897,1?36,0

Фенантрен, мг 0 292,0?19,9 323,3?7,8 753,0?0

Через 0, 3, 7 и 10 суток культивирования фенантрен и продукты его метаболизма экстрагировали из культуральной жидкости хлороформом. Анализ остаточного фенантрена проводили двумя методами спектрофотометрически по предварительно построенной калибровочной кривой и методом газовой хроматографии. Результаты полученные этими двумя методами хорошо соответствуют.

Было обнаружено, что через 3 суток гриб метаболизировал около 60% фенантрена, а через 7 суток деструкция составляла около 95% (табл.5). В аналогичных исследованиях Bezalel et al., проводимых на богатой среде для базидиомицетов гриб Pleurotus ostreatus метаболизировал 94% 14С-фенантрена за 11 дней (Bezalel et al., 1996 -2).

Таблица 4: Деградация фенантрена Pleurotus ostreatus D1 в условиях погруженного культивирования на богатой среде для базидиомицетов.

Время культивирования, сутки

Метод анализа 0 3 7 10

СФ 4,06?0 1,348?0,16 0,128?0,01 0,09?0,01

Деструкция, % 0 66,8?3,9 96,8?0,3 97,8?0,3

ГХ 3,95?0,2 1,64?0,12 0,22?0,11 0,13?0,079

Деструкция, % 0 58,6?3,1 94,5?2,8 96,7?2,0

Rf метаболитов,

Silufol UV-254 0,95 0,95; 0,85 0,95; 0,85; 0,32 0,95; 0,91;

0,85

Эти же авторы показали, что только 1,8% 14С-фенантрена было минерализовано до СО2, примерно 52% фенантрена метаболизировалось до транс-9,10-дигидрокси-9,10-дигидрофенантрена, фенантрен-транс-9,10-дигидродиол составлял 28%, дифеновая кислота и неидентифицированные метаболиты - 17% /4,5/.

Мы также попытались обнаружить продукты деградации фенантрена грибом Pleurotus ostreatus D1. Спектрофотометрический анализ хлороформенных экстрактов культуральной жидкости показал постепенное снижение всех максимумов поглощения, характерных для фенантрена. Появления дополнительных максимумов поглощения обнаружено не было (рис. 8).

Рисунок 2: Спектры поглощения экстрактов культуральной жидкости после роста Pleurotus ostreatus D1 на богатой среде для базидиомицетов с фенантреном.

Тонкослойная хроматография этих же экстрактов показала наличие нескольких веществ. Вещество с Rf=0,95 и ярко-фиолетовой флюоресценцией в ультрафиолете присутствовало на протяжении всего времени культивирования и, по-видимому, являлось неметаболизированным фенантреном. Также на протяжении всего времени эксперимента присутствовало вещество с Rf=0,85 и темно-зеленой окраской под ультрафиолетом. Наиболее ярким это вещество было на 7 сутки культивирования. Два вещества с Rf=0,32 и Rf=0,91 присутствовали только на 7 и 10 сутки, соответственно. Ни одно из обнаруженных веществ по Rf и цвету флюоресценции не соответствовало 2,2’-дифеновой кислоте.

Выявленные метаболиты были разделены препаративной тонкослойной хроматографией и элюированы хлороформом. На рисунке 9 представлены спектры поглощения полученных метаболитов. Спектр поглощения 1 соответствует метаболиту с Rf=0,95, спектр поглощения 2 - метаболиту с Rf=0,85, а спектр поглощения 3 - метаболиту с Rf=0,32.

Рисунок 3: Спектры поглощения метаболитов фенантрена.

Нам не удалось идентифицировать полученные метаболиты сравнением их спектров поглощения со спектрами поглощения известных метаболитов.

В течение всего времени эксперимента контролировали рН. За первые три дня культивирования рН среды смещался в щелочную сторону как в контрольном варианте, так и в варианте с фенантреном и далее почти не изменялся (табл.6).

Таблица 5: рН среды культивирования.

Время культивирования, сутки

Варианты 0 3 7 10

Контроль 5,4 6,5 7,0 7,0

Фенантрен 5,4 6,6 7,2 6,8

На протяжении всего времени культивирования гриб продуцировал лакказу (табл.7). В контрольном варианте максимума 99,5 мкмоль/мин/мл активность лакказы достигала на 4 сутки, в экспериментальном варианте - 118 мкмоль/мин/мл - на 8 сутки. В исследованиях Bezalel et al. лакказная активность гриба Pleurotus ostreatus в присутствии фенантрена составляла только 57 ед./мл /5/.

Таблица 6: Динамика активности лакказы (мкмоль/мин/мл).

время культивирования, сутки

Варианты 0 1 2 3 4 7 8 9 11

Контроль 3,3?1,7 3,6?0,7 21,9?2 45,0?2 99,5?1 95,4?0 66,6?2 70,8?3 62,6?2

Фенантрен 3,3?1,7 3,0?0,5 11,0?2 17,4?2 71,8?1 86,1?1 118?10 116,9? 43,1?3

Рисунок 4: Динамика активности лакказы.

До 7 суток наблюдалось некоторое ингибирование активности лакказы. На 8-9 сутки происходит резкое увеличение активности фермента в опытном варианте, тогда как в контроле в это время активность снижается (рис.10). Подобная динамика может быть связана с тем, что в первые 7 суток лакказную активность ингибирует фенантрен и/или продукты его деградации, затем в процессе метаболизма образуются некоторые интермедиаты, которые могут быть и индуктором, и субстратом для лакказы, вследствие чего происходит резкое увеличение активности фермента.

Таким образом, обнаружено, что на богатой среде для базидиомицетов гриб Pleurotus ostreatus D1 метаболизировал до 97 % фенантрена. Методом тонкослойной хроматографии было выделено 3 вещества, одно из которых предположительно является неметаболизи-рованным фенантреном, два других идентифицировать пока не удалось.

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

3.1 Поддержание культур грибов и получение инокулята.

В работе был использован гриб белой гнили Pleurotus ostreatus D1, любезно предоставленный лабораторией микробиологии ИБФРМ РАН* .

Культуру гриба поддерживали на скошенном агаре с богатой средой для базидиомицетов (BRM) рН 5,5 следующего состава: NH4NO3 - 0,724 г/л, KH2PO4 - 1,0 г/л, MgSO4*7H2O - 1,0 г/л, KCl - 0,5 г/л, дрожжевой экстракт - 0,5 г/л, FeSO4*7H2O - 0,01 г/л, ZnSO4*7H2O - 0,0028 г/л, CaCl2*2H2O - 0,033 г/л, D-глюкоза - 10 г/л, пептон - 10 г/л (Bezalel et al., 1996 -3).

Для получения инокулята гриб культивировали в течение 7 суток на богатой среде для базидиомицетов, в колбах объемом 250 мл со 100 мл среды, на качалке при 200 об/мин и 290С.

3.2 Твердофазное культивирование гриба Pleurotus ostreatus D1.

Твердофазное культивирование гриба Pleurotus ostreatus D1 проводили в колбах. Навески лузги ( 5 г ) помещали в колбы, увлажняли 20 мл водопроводной воды, стерилизовали 0,5 час при 1 атм. Засевали внесением 5 мл инокулята (примерно 200 мг по сырому весу). Культивирование проводили 20 суток.

3.3 Погруженное культивирование гриба Pleurotus ostreatus D1.

Погруженное культивирование проводили на средах следующего состава:

А. среда Кирка: KH2PO4 - 2,0 г/л, MgSO4 - 0,348 г/л, CaCl2*2H2O -0,143 г/л, NH4NO3 - 1,02 г/л, раствор микроэлементов 10 мл/л, тиамин - 0,5 мл/л. рН среды 4,5 поддерживали 25 мМ Na-тартратным буфером. В качестве источника углерода и энергии использовали глюкозу, мальтозу или целлюлозу в конечной концентрации 1% (Kirk et al., 1981).

Культивирование проводили при 130 об/мин и 290С, через 3 суток в колбы добавили фенантрен до конечной концентрации 50 мг/л (5 мг/100 мл). Фенантрен предварительно растворяли в хлороформе (5 мг/100 мкл), в контрольные варианты вносили 100 мкл хлороформа.

Все варианты были в трех повторностях.

Б. Богатая среда для базидиомицетов рН 5,5 (BRM): NH4NO3 - 0,724 г/л; KH2PO4 - 1,0 г/л; MgSO4*7H2O - 1,0 г/л; KCl - 0,5 г/л; дрожжевой экстракт - 0,5 г/л; FeSO4*7H2O - 0,01 г/л; ZnSO4*7H2O - 0,0028 г/л; CaCl2*2H2O - 0,033 г/л; D-глюкоза - 10 г/л; пептон - 10 г/л (Bezalel et al., 1997).

Культивирование проводили при 130 об/мин и 290С, через 3 суток в колбы добавили фенантрен до конечной концентрации 50 мг/л (5 мг/100 мл). Фенантрен предварительно растворяли в хлороформе (5 мг/100 мл), в контрольные варианты вносили 100 мкл хлороформа.

Все варианты были в трех повторностях.

3.4 Определение прироста мицелия.

В момент посева 5 мл инокулята наносили на предварительно взвешенные фильтры, которые затем высушивали до постоянного веса и подсчитывали вес биомассы гриба. Через 3, 7 и 10 суток после внесения фенантрена колбы снимали, мицелий отделяли фильтрованием через предварительно взвешенные фильтры, которые затем высушивали до постоянного веса и подсчитывали вес мицелия.

3.5 Методы экстракции.

Остаточный фенантрен и продукты его деградации выделяли из культуральной жидкости экстракцией: мицелий на фильтрах промывали 3 мл хлороформа, эту промывку переносили в культуральную жидкость и встряхивали 5-10 мин. при 150 об/мин., экстракты отбирали и переносили в пробирки. Процедуру повторяли дважды, экстракты объединяли и сушили безводным Na2SO4, переносили в мерные пробирки, осадок Na2SO4 промывали 1 мл хлороформа, экстракты и промывку объединяли и снова сушили безводным Na2SO4. Экстракт упаривали до минимального объема.

3.6 Хроматографические методы.

3.6.1 Газовая хроматография.

Количество фенантрена контролировали методом газовой хроматографии на хроматографе Биохром 1 с кварцевой капиллярной колонкой с фазой OV-101, газ-носитель гелий, скорость 1,2 мл/мин, пламенно-ионизационный микродетектор, температура в колонке – 2300С, в камере впрыскивания – 2300С, в капиллярном детекторе – 2500С, приведенное время удерживания фенантрена 1 мин. 20 с, подсчет результатов проводили на интеграторе УЦ-26.5.

3.6.2 Тонкослойная хроматография.

Использовали пластины с силикагелем Silufol UV-254 ("Kavalier", Чехия).

Анализ экстрактов культуральной жидкости проводили в системе этилацетат:метанол (4:1).

Хроматографию экстрактов реакционных смесей лакказы проводили в системе бензол:этилацетат (2:1). В качестве стандартов использовали растворы ПАУ в хлороформе.

Rf продуктов реакции определяли как отношение расстояния пройденного веществом к расстоянию пройденному растворителем .

3.7 Спектральные методы.

Спектрофотометрический анализ экстрактов проводили на спектрофотометре СФ-26 в 1 см кварцевых кюветах, в диапазоне 240-340 нм. Количество фенантрена определяли спектрофотометрически по предварительно построенной калибровочной кривой при 254 нм.

Спектры поглощения лакказы измеряли на спектрофотометре СФ 26 (Россия) в интервале 230-785 нм в 50 мМ K-Na фосфатном буфере рН 6,0 при 220С, концентрация белка 525мкг/мл.

3.8 Определение активности лакказы.

Определение активности лакказы проводили спектофотометрически, на спектрофотометре СФ 26 (Россия) в кварцевых кюветах с длиной оптического пути 1 см.

За единицу активности принимали количество фермента, катализирующего превращение 1 мкмоль субстрата или образование 1 мкмоль продукта.

Удельную активность определяли как мкмоль/мин/мг белка.

В случае невозможности определения концентрации белка (темно-коричневое окрашивание препарата водорастворимым лигнином) активность фермента выражали в условных единицах - мкмоль/мин/мл препарата.

Активность лакказы определяли спектрофотометрически по скорости образования продукта окисления сирингальдазина (увеличение поглощения при 525 нм, коэффициент молярной экстинкции 65000) (Leonowicz, Crzywnowicz 1981). Cостав реакционной смеси: 50 мМ К-Na-фосфатный буфер рН 6,0 с 10% (по объему) этанола, 50 мкМ сирингальдазина, ферментный препарат.

Для идентификации лакказы проводился тест на окисление тирозина спектрофотометрически при 475 нм. Состав реакционной смеси: 50 мМ К-Na-фосфатный буфер рН 6,0, 5 мкмоль L-тирозина, ферментный препарат (Pomerantz, Murthy 1974).

При определении субстратной специфичности лакказы в качестве субстратов использовали: сирингальдазин - за ходом реакции следили по скорости образования продукта при 525 нм (Leonowicz, Crzywnowicz 1981); АБТС, - по образованию продукта при 436 нм (Niku-Paavola et al., 1988); пирокатехин, - по образованию продукта при 410 нм; гидрохинон, - по убыли субстрата при 247 нм (Королева и др., 2001). Для подсчета Vmax и Кm использовалась программа ENZFITER (Biosoft, Cambridge).

3.9 Реактивы и материалы.

В качестве субстрата при твердофазной ферментации гриба использовали лузгу подсолнечника.

В работе использовали пирокатехин, гидрохинон, сирингальдазин (Sigma, США), АБТС, ?-меркаптоэтанол (Fluka, Швейцария), ЭДТА, фенантрен, антрацен, флюорен, флюорантен, пирен (Fluka, Швейцария), бензо[a]пирен (Sigma, США).

Остальные реактивы отечественного производства марки "осч" и "хч".

Полученные результаты подвергали статистической обработке /70/.

ВЫВОДЫ

1)Разработана методика анализа фенантрена в культуральной жидкости и мицелии гриба после роста Pleurotus ostreatus D1 на средах, содержащих фенантрен.

2)Обнаружено, что в условиях погруженного культивирования на минеральной среде Кирка гриб Pleurotus ostreatus D1 метаболизировал до 38% фенантрена за две недели, а использование в качестве ростового субстрата мальтозы увеличивало деструкцию до 79%.

3)Изучение влияния ПАВ на деградацию фенантрена показало, что tween-80 увеличивал деструкцию фенантрена в 2 раза, и она составляла 79 % за 7 суток.

4)Обнаружено, что на BRM гриб Pleurotus ostreatus D1 метаболизировал до 97% фенантрена за 10 суток культивирования. Методом ТСХ было выделено 3 вещества, одно из которых предположительно является остаточным фенантреном, два других идентифицировать пока не удалось.

5)Показано, что гриб Pleurotus ostreatus D1 активно метаболизировал фенантрен как на минеральной среде Кирка, так и на BRM. Причем в первом случае не происходит продукции лакказы, которая расщепляет ароматическое кольцо, а на BRM продукция этого фермента происходит, и его активность максимума достигает на 10 сутки культивирования. Таким образом можно говорить о множественных ферментных путях метаболизма фенантрена этим грибом.

ОСНОВНЫЕ ПРАВИЛА ТЕХНИКИ БЕЗОПАСНОСТИ И ОХРАНЫ ТРУДА

1 Инструкция: "Основные правила техники безопасности при работе с кислотами и щелочами"

1.1 Общие положения

1.1.1 Концентрированные кислоты и щелочи представляют собой агрессивные жидкости, способные разрушать различные материалы, ткани, кожу человека.

1.1.2 В лаборатории концентрированные растворы кислот хранятся в толстостенных стеклянных сосудах, емкостью не более двух литров на полках вытяжного шкафа в специальных подносах.

1.1.3 Концентрированные растворы щелочей сильно выщелачивают стеклянную посуду, поэтому их целесообразно хранить в полиэтиленовой посуде.

1.1.4 Все работы, связанные с концентрированными кислотами, а также легко летучими кислотами и твердыми щелочами проводятся только под тягой с соблюдением мер личной предосторожности.

1.2 Перед началом работы следует: а) включить тягу; б) надеть халат, резиновые перчатки, защитные очки; в) перед переливанием дымящихся кислот (соляной, азотной), раствора аммиака необходимо защитить органы дыхания, надев респиратор, противогаз.

1.3. Во время работы следует: а) при разбавлении концентрированной серной кислоты переливать кислоту в воду, а не наоборот; б) смешивание, разбавление, нейтрализацию кислот и щелочей проводить в термостойкой, толстостенной либо фарфоровой посуде; в) засасывание кислот и щелочей в пипетку проводить грушей, при разливе концентрированных кислот использовать сифоны.

Запрещается:

а) засасывать кислоты и щелочи в пипетки ртом;

б) вынимать большие бутылки с концентрированной кислотой из корзин и ставить их на пол;

в) производить разлив кислот без сифона;

г) брать твердые щелочи руками;

д) наклонятся над кипящими кислотами и щелочами;

е) сливать в раковину не нейтрализованные щелочи и кислоты;

ж) хранить вместе концентрированную кислоту и легкоокисляющиеся органические вещества во избежание взрыва;

з) хранить совместно концентрированные кислоты и щелочи.

1.4 После работы следует:

а) в случае пролива концентрированной кислоты или щелочи жидкость засыпать песком, мокрый песок удалить и остатки смыть водой;

б) нейтрализовать в фарфоровой посуде остатки кислот и щелочей.

1.5 При несчастном случае следует:

а) в случае пролива концентрированной кислоты или щелочи на кожу немедленно промыть пораженный участок большим количеством воды в течении 10-15 минут;

б) нейтрализовать кислоту содой, а щелочь раствором борной или уксусной кислоты.

2 Инструкция: " Правила техники безопасности при работе с электроприборами"

2.1 Общие положения.

2.1.1 Работа с электрическими приборами требует особо тщательного соблюдения правил техники безопасности.

2.1.2 Установлено, что токи величиной 0,03 – 0,1 А в течении 1-2 секунд вызывают потерю сознания или даже смерть. Особенно опасно прикосновение к тковедущим частям тыльной стороной ладони и шеей. В этом случае смертельное поражение может иметь место при гораздо меньших токах.

2.1.3 Необходимым условием безопасности работы с электроприборами является наличие защитного заземления.

2.2 Перед началом работы с электроприборами необходимо внимательно ознакомится с инструкцией по их эксплуатации.

2.3 В процессе работы требования инструкции по эксплуатации должны соблюдаться неукоснительно. В случае обнаружения неисправности в приборе нужно немедленно прекратить работу, выключить источник электропитания прибора и сообщить об этом заведующему лабораторией. В случае попадания человека под напряжение следует немедленно выключить общий рубильник.

Категорически запрещается:

а) работать с незаземленным приборам;

б) прикасаться руками к клеммам приборов, находящихся под напряжением;

в) снимать кожух прибора, включенного в сеть 220 В;

г) пользоваться измерительными приборами, держа их на коленях;

д) производить клейку и монтаж в схеме прибора, находящегося под напряжением;

е) проверять на ощупь наличие напряжения и нагрев токоведущих частей прибора;

ж) работать с приборами без изолирующего коврика под ногами;

з) оставлять без наблюдения прибор или схему, находящиеся под напряжением4

2.4 После окончания работы с электроприбором необходимо выключить его тумблером "Сеть" и выдернуть шнур из розетки электросети.

2.5 При возникновении пожара на электроустановке ее следует немедленно отключить и потушить огонь кошмой или углекислотным огнетушителем типа ОУ-2, ОУ-5, ОУ-8, УП-2. Категорически запрещается заливание водой находящихся под напряжением токоведущих частей электроустановки или прибора.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ.

1. Ander P., Eriksson K.-E. (1976) The importance of phenol oxidase activity in lignin degradation by the white-rot fungus Sporotrichum pulverulentum. Arch. Microbiol. v.109 pp.1-8.

2. Archibald F., Roy B. (1992) Production of manganic chelates by laccase from the lignin-degrading fungus Trametes (Coriolus) versicolor. Appl. Environ. Microbiol. v.58 pp.1496-1499.

3. Bezalel L., Hadar Y., Cerniglia C.E. (1996) Mineralization of aromatic hydrocarbons by the white rot fungus Pleurotus ostreatus. Appl.Environ.Microbiol. v.62 pp.292-295, -1.

4. Bezalel L., Hadar Y., Cerniglia C.E. (1997) Enzymatic mechanisms involved in phenanthrene degragation by the white rot fungus Pleurotus ostreatus. Appl.Environ.Microbiol., v.63, p.2495-2501.

5. Bezalel L., Hadar Y., Fu P.P., Freeman J.P., Cerniglia C.E. (1996) Metabolism of phenanthrene by the white rot fungus Pleurotus ostreatus. Appl.Environ.Microbiol. v.62 pp.2547-2553, -2

6. Bezalel L., Hadar Y., Fu P.P., Freeman J.P., Cerniglia C.E. (1996) Initial oxidation products in the metabolism of pyrene, anthracene, fluorene and dibenzothiophene by the white rot fungus Pleurotus ostreatus. Appl.Environ.Microbiol. v.62 pp.2554-2559, –3.

7. Bogan B. W., Lamar R.T. (1995) One-electrone oxidation in the degradation of creosote polycyclic aromatic hydrocarbons by Phanerochaete chrysosporium. Appl. Environ.Microbiol., v.61, p.2631-2635.

8. Bogan B.W., Lamar R.T. (1996) Polycyclic aromatic hydrocarbon-degrading capabilities of Phanerochaete laevis HHB-1625 and its extracellular ligninolytic enzymes. Appl.Environ.Microbiol. v.62 pp.1597-1603.

9. Bohmer S., Messner K., Srebotnik E. (1998) Oxidation of phenanthrene by a fungal laccase in the presence of 1-hydroxybenzotriazole and unsaturated lipids. Biochem.Biophys.Res.Commun. 244: 233-238..

10. Bollag J.-M., Shutteworth K. L., Anderson D. N. (1988) Laccase-mediated detoxification of phenolic compounds. Appl.Environ. Microbiol. v.54 pp.3086-3091.

11. Bourbonnais R., Paice M.G. (1990) Oxidation of non-phenolic substrates. An expanded role for laccase in lignin biodegradation. FEBS Lett. 267: 99-102.

12. Bressler C., Fedorak P. M., and Pickard M. A. (2000) Oxidation of carbazole, N-ethylcarbazole, fluorine, and dibenzothiophene by the laccase of Coriolus gallica. Bitechnol. Lett. v.2 pp.1119-1125.

13. Brodkorb T.S., Legge R.L. (1992) Enhanced biodegradation of phenanthrene in oil tar-contaminated soils supplemented with Phanerochaete chrysosporium. Appl.Environ.Microbiol. v.58, pp.3117-3121.

14. Bumpus J.A. (1989) Biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons by Phanerochaete chrysosporium. Appl.Environ.Microbiol. v.55 pp.154-158.

15. Buswell J.A., Odier E. (1987) Lignin-biodegradation. Critical Review in Biotechnilogy v.6, p.1-60.

16. Call H. P., Mucke I. (1997) History, overview and applications of mediated lignolytic systems, especially laccase-mediator-systems (Lignozym –process). J. Biotechnol. v.53 pp.163-202.

17. Cerniglia C.E. (1993) Biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons. Curr. Opin.Biotechnol., v.4, p.331-338.

18. Collins P.J.,Kotterman J.J., Field J.A., Dobson A.D.W. (1996) Oxidation of anthracene and benzo[a]pyrene by laccase from Trametes versicolor. Appl. Environ.Microbiol. 62: 4563-4567.

19. De Vries O. M. H., Koista W. H. C. F., Wessels G. H. (1986) Formation of an extracellular laccase by Schizophyllum commune dicarion. J. Gen Microbiol v.132 pp.2817-2826.

20. Dhawale S.W., Dhawale S.S., Dean-Ross D. (1992) Degradation of phenanthrene by Phanerochaete chrysosporium occurs under ligninolytic as well as nonligninolytic conditions. Appl.Environ.Microbiol. v.58 pp.3000-3006.

21. Durrens P. (1981) The phenoxdases of ascomycete Podospora anserina: three forms of the major laccase activity. Arch. Microbiol. v.130 pp.121-124.

22. Eggert C., Temp U., Dean J. F. D., and Erikkson K.-E. (1996) FEBS Lett., v.391 pp.144-148.

23. Fahreus A., Reinhammar B., (1967) Large scale production and purification of laccase from culture of the fungus Polyporus versicolor and some properties of laccase. Acta Chem. Scand v.21 pp. 2367-2378.

24. Froechner S.C., Eriksson K.-E. (1974) Purification and properties of Neurospora crassa laccase. J. of Bacteriology v.120 pp.458-465.

25. Gigi O., Marbach I., Mayer A.M. (1981) Properties of gallic acid used extracellular laccase of Botrytis cinerea. Phytochemestry v.20 pp.1211-1213.

26. Haars A., Chet I., Hutermann (1981) Effect of phenolic compounds and tannin on growth and laccase activity of Fomes annosus. Eur.J.Forest Pathol. v.11 pp.67-76.

27. Hammerli S.D., Leisola M.S.A., Sanglard D., Fiechter A. (1986) Oxidation of benzo[a]pyrene by extracellular ligninases of Phanerochaete chrysosporium: veratryl alcohol and stability of ligninase. J.Biol.Chem. v.261 pp.6900-6903.

28. Hanna P.M., McMillin D.R., Pasenkiewcz-Gierula M., Antholine W.E., Reinhammar B. (1988) Type 2-depleted fungal laccase. Biochem.J. v.253 pp.561-568.

29. Harkin J. M., Larsen M. J., Obst J. R. (1974) Use of syringaldazine for detection of laccase in sporofores of wood rotting fungi. Mycologia v.66 pp.469-476.

30. Hatakka A.I. (1985) Degradation of veratric acid other lignin-relaited aromatic compounds by the white-rot fungus Picnoporus cinnabarinus.Arch. Microbiol. v.141 pp.22-28.

31. Higuchi T. (1989) Mechanisms of lignin degradation by lignin peroxidases of white-rot fungi. In: Plant Cell Wall Polymers. Biogenesis and Biodegradation. (Lewis n. G., Paice M. G., Eds.) pp.482-502. ACS Symp. ser. 399. ACS, Washington, Всю

32. Higuchi T. (1990) Lignin biochemistry: biosynthesis and biodegradation Wood Sci. Technol. v.24 pp.23-63.

33. Johannes C., Majcherezyk A., and Hutterman A. (1996) Degradation of anthracene by laccase of Trametes versicolor in the presence of different mediating substrate compounds. Appl. Microbiol. Biotechnol. v.46 pp.313-317/

34. Johannes C., Majcherezyk A., Huttermann A. (1998) Oxidation of acenaphthene and acenaphthylene by laccase of Trametes versicolor in a laccase-mediator system. J. of Biotechnol. v.62 pp.151-156.

35. Jonas U., Hammer E., Schauer F., Bollag J.-M. (1998) Transformation of 2-hydroxidibenzofuran by laccases of the white rot fungi Trametes vsrsicolor and Picnoporus cinnabarinus and characterization of oligomerization products. Biodegrad. v.8 pp. 321-328.

36. Kawai S., Umezawa T., Higuchi T. (1988a) Ca-CB cleavage of B-0-4 lignin model compounds by laccase of Coriolus versicolor. Arch. Biochem. Biophys. v.262 pp.99-100.

37. Kawai S., Umezawa T., Shimada M., Higuchi t. (1988b) Aromatic ring cleavage of 4,6-di(tret-butyl)guaiacol, a phenolic lignin model compound, by laccase Coriolus vrsicolor. FEBS v.236 PP.309-311.

38. Kersten P. J. (1990) Glyoxaloxydase of Phanerochaete chrysosporium: its characterization and activation by lignin peroxidase. Proc. Nat 1. Acad. Sci.USA v.87 pp.2936-2940.

39. Kirk T. K., Shimada M. (1985) Lignin biodegradation: the microorganisms involved and the physiology and biochemistry of degradation by white rot fungi. in: Higuchi T. (ad.) Biosynthesis and Biodegradation of wood components pp.579-605.

40. Kirk T.K., Farrell R. L. (1987) Enzymatic "combustion": The microbial degradation of lignin. Ann.Rev.Microbiol. v.41 pp.465-505.

41. Kottermann M.J.J., Vis E.H., Field J.A. Successive mineralization and detoxification of benzo[a]pyrene by the white rot fungus Bjerkandera sp. strain BOS55 and indigenous microflora.// (1998) Appl.Environ.Microbiol. v.64, pp.2853-2858.

42. Kurtz M.B., Champe S.P. (1982) Purification and characterization of the conidial laccase of Aspergillus nidulans. J. Bacteriol. v.151 pp.1338-1345.

43. Leatham G., Stahmann M.A. (1981) Studies of the laccase of Lentinus edodes: specificity, localizaton and association with the development of fruiting bodies J.Jen.Microbiol., v125, pp147-157.

44. Leontievsky A. A., Vares,T., Lankinen,P., Shergill,J..K., Pozdnyakova,N.N., Myasoedova,N.M., Kalkkinen,N., Golovleva,L.A., Cammack,R., Thurston,C.F., and Hatakka, A. 1997. Blue and yellow laccases of ligninolytic fungi. FEMS Microbiol. Lett. 156: 9-14 – 1.

45. Leontievsky A.A., Mysoedova N.M., Pozdnyakova N. N., Golovleva L.A. Yellow laccase of Panus tigrinus oxidizes non-phenolic substrates without electron-transfer mediators. FEBS Lett. 1997. V. 413. Pp. 416-418. -2

46. Majcherezyk A., Johannes C. (2000) Radical mediated indirect oxidation of a PEG-coupled polycyclic aromatic hydrocarbon (PAH) model compound by fungal laccase. Biochim. Biophis. Act. v.1474 pp.157-162.

47. Majcherezyk A., Johannes C., Huttermann A. (1998) Oxidation of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH) by laccase of Trametes versicolor. Enzym Microbial Technol. v.22 pp.335-341.

48. Mayer A.M., & Harel E. (1979) Polyphenol oxidases in plants. Phytochemistry, v.18 pp.193-215.

49. Milstein O., Nicklas B., Huttermann A. (1989) Oxidation of aromatic compounds in organic solvents with laccase from Trametes versicolor. Appl.Environ.Microbiol. v.31 pp.70-75.

50. Moen M.A., Hammel K.E. (1994) Lipid peroxidation by the manganese peroxidase of Phanerochaete chrysosporium is the basis for phenanthrene oxidation by the intact fungus. Appl.Environ.Microbiol. v.60 pp.1956-1961.

51. Molitoris H.P., and Esser K. (1970) Arch. Microbiol. v.3 pp.267-276.

52. Morgan P., Lewis T., Watkinson R.J. (1991) Comparison of abilities of white rot fungi to mineralize selected xenobiotic compounds. Appl.Microbiol.Biotechnol. v.34, p.693-696.

53. Palmeri G., Giardina P., Marzullo L., Desideri B., Nitti G., Cannio R., Sannia G. (1993) Stability and activity of a phenol oxidase from the ligninolytic fungus Pleurotus ostreatus. Appl. Microbiol Biotechnol. v.39 pp.632-636.

54. Pomerantz S. H., Murthy V. V. (1974) Purification and properties of tyrosinases from Vibrio tyrosinaticus. Arch. Biochem. Biophys. v.160 pp.73-82.

55. Rama R., Mougin C., Boyer F.-D., Kollmann A., Malosse C., and Sigoillot J.-C. (1998) Biotransformation of benzo[a]pyrene in bench scale reactor using laccase of Pycnoporus cinnabarinus. Biotechnol. Lett. v.20 pp.1101-1104.

56. Rogalski J., Jozwik E., Hatakka A., Leonowicz A. (1995) Immobilization of laccase from Phlebia radiata on controlled porocity glass. Journal of Molecular Catalysis A: Chemical 95 pp.99-108.

57. Roy-Arcand J., Archibald J. S. (1991) Direct dechlorination of chlorophenolic compounds by laccases from Trametes versicolor. Enzym. Microb. Technol. v.13 pp.194-203.

58. Sack U., Fritsche W. (1987) Enhancement of pyrene mineralization in soil by wood-decaying fungi. // FEMS Microbiol.Ecol. v.22, pp.77-83.

59. Sack U., Heinze T. M., Deck J., Cerniglia C.E., Cazau M.C., Fritsche W. (1997) Novel metabolites in phenanthrene and pyrene transformation by Aspergillus niger. Appl.Environ.Microbiol. v.63, p.2906-2909.

60. Saloheimo M., Niku-Paavola M.-L., Knowles J.K.C. (1991) Isolation and structural analysis of the laccase gene from the lignin-degrading fungus Phlebia radiata. J. Gen. Microbiol. v.137 pp.1537-1544.

61. Sims J. L., Sims R. C., Matthews J. E. (1990) Approach to bioremediation of contaminated soil. Hazard. Waste Hazard. Mates. v.7 pp.117-148.

62. Sutherland J.B., Selby A.L., Freeman J.P., Evans F.E., Cerniglia C.E. (1991) Metabolism of phenanthrene by Phanerochaete chrysosporium. Appl.Environ.Microbiol. v.57 pp.3310-3316.

63. Thurston C.F. (1994) The structure and function of fungal laccases. Microbiology, v.140 pp.19-26.

64. Valero E., Garcia-Moreno M., Varon R., Garcia-Garmona F. (1991) Time-dependent inhition of grape polyphenol oxidase. J. Agric. Food Chem. v.39 pp.1043-1046.

65. Wariishi H., Huang J., Dunford H. B., Gold M. H. (1991) Reactions of lignin peroxidase compounds I and II with veratryl alcohol. J. Biol. Chem. v.266 pp.20694-20699.

66. Wood D. A., Smith J. F. (1987) The cultivation of mushrooms. In essays in agricultural and food microbiology, pp.309-343. d. by J.R. Norris G. L. Pettipher.

67. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика М. "Мир" 1991.

68. Леонтьевский А.А., Мясоедова Н.М., Баскунов Б.П., Позднякова. Н.Н., Варес Т., Калккинен Н., Хатакка А.И., Головлева Л.А. Реакция голубых и желтых лакказ с модельными соединениями лигнина. Биохимия 1999. Т. 64, вып. 10. С. 1362-1369.

69. Очистка окружающей среды от углеводородных загрязнений/ В.Ж.Аренс, А.З.Саутин, О.М.Гридин, А.О. Гридин. - М.: Интербук, 1999.-371с.

70. Позднякова Н.Н. (1997) Сравнительная характеристика оксидаз лигнинолитических грибов Panus tigrinus 8/18 иCoriolus versicolor F-116. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук, Пущино.

71. Рокицкий П. Ф. Биологическая статистика. Минск "Высшая школа", 1973.